西北农林科技大学赵善廷教授团队与西安医学院柴学军教授合作在杜仲功效研究方面又取得新突破，他们最新的科研成果“Eucommia ulmoides Oliv. Bark Extracts Alleviate MCAO/Reperfusion-Induced Neurological Dysfunction by Suppressing Microglial Inflammation in the Gray Matter”（中文：“杜仲提取物通过抑制大脑灰质中小胶质细胞炎症改善脑血栓引起的神经功能损伤”）近日在国际著名学术期刊《International Journal of Molecular Sciences》正式发表，该研究揭示了杜仲水提物通过抑制脑缺血后大脑内小胶质细胞炎症，减轻缺血再灌注诱导的神经功能障碍，促进脑中风后遗症的大脑功能康复，并阐明了其细胞和分子机制。博士研究生潘佳荣和西安医学院柴学军教授为共同第一作者，赵善廷教授和朱晓岩副教授为通讯作者。
脑卒中俗称脑中风，具有高发病率、高致残率、高死亡率和高复发率等特点，脑卒中患者常遗留各种大脑功能障碍，如偏瘫、言语障碍、认知障碍、吞咽障碍等，严重影响患者的生活质量，多数患者失去工作能力甚至生活不能自理，需要进行长期康复治疗，给家庭和社会带来沉重的经济负担和巨大的护理压力。杜仲是我国特有树种，杜仲皮在“神农百草经”被列为上品中药材，具有补肝益肾等功效，常被用于治疗腰酸腿疼。赵善廷教授团队长期以来致力于杜仲的功效研究和产品开发，他们以前的研究结果表明，杜仲提取物具有神经保护、抗炎和调节自噬等多种药理作用。在本研究中作者首先利用线栓建立小鼠脑中风动物模型，然后给动物饲喂杜仲提取物，最后利用行为学、网络药理学、免疫荧光组织化学、激光共聚焦显微镜和Western-blot等先进的细胞生物学和分子生物学技术，深入细致地研究了杜仲提取物对脑缺血后神经元的保护作用及细胞和分子机制。组织学和行为学研究结果表明，饲喂杜仲提取物可显著减少缺血再灌注损伤小鼠的脑梗死面积并改善脑缺血引起的神经功能障碍。免疫荧光组织化学染色和Western blot研究结果显示，杜仲提取物可显著减轻小鼠皮质缺血引起的小胶质细胞活化，抑制促炎介质的产生，包括IL-1β、IL-6和TNF-α，更重要的是，与模型组相比，杜仲提取物治疗组TLR4、p-p38和NF-κB的蛋白表达水平显著降低。这表明杜仲水提物具有缓解大脑缺血损伤、抑制神经炎症和保护神经元的功效，为脑中风后遗症的治疗提供了一种有前途的候选药物。
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40004043/
图1. 实验设计和杜仲提取物功效机制示意图
图2 杜仲提取物改善脑血栓造成的行为缺陷并降低脑梗死体积
为探究杜仲提取物对缺血性运动协调障碍的神经保护作用，本研究采用神经功能缺损评分联合行为学测试的方法系统评估了杜仲提取物对缺血性脑卒中后神经行为学功能的影响。实验结果显示，假手术组小鼠（正常对照组）未出现明显的神经功能缺损，而模型组小鼠（脑血栓组）则表现出显著的神经功能损伤和脑梗死。与模型组相比，饲喂杜仲提取物显著降低了脑血栓后7天的神经功能缺损评分，并减少了脑梗死体积。在转棒实验中，模型组小鼠的运动协调能力明显受损，表现为停留时间较假手术组显著缩短；而杜仲提取物组小鼠的停留时间较模型组显著延长。爬杆实验中，模型组小鼠运动失调明显，表现为从杆子上掉落或滑落（记为最大时间30 s），饲喂杜仲提取物后小鼠从杆子下降到地面所需的时间与正常小鼠相似。悬挂实验进一步证实，饲喂杜仲提取物显著改善了缺血小鼠的抓握能力。这些研究结果表明，杜仲提取物通过减少脑梗死体积和改善神经功能，有效减轻了缺血引起的运动协调障碍。
图3 饲喂杜仲提取物治疗缺血性脑卒中的网络药理学预测。
最近，网络药理学已成为研究药物作用机制和从复杂系统（草药配方、成分草药、复方制剂等）中发现有效物质的重要手段。对于脑卒中研究，网络药理学提供了一种新的“多组分、多靶点、多通路”网络模型。作者采用网络药理学策略，探索饲喂杜仲提取物对脑卒中后的神经保护作用机制。通过Venn分析，筛选出283个与缺血性卒中和主要成分相关的交叉靶点。通过PPI网络分析，共在283个重叠靶点中鉴定出101个与杜仲提取物治疗缺血性卒中相关的核心靶基因。然后使用STRING在线工具，以便研究与杜仲提取物对缺血性卒中治疗作用密切相关的潜在机制。GO富集分析结果表明，炎症反应可能是相关的基本生物学过程，具有相对较多的基因数量和相对较高的p值。此外，根据KEGG通路富集分析的结果，101个核心靶基因中有19个富集MAPK信号通路，11个核心靶基因富集TNF信号通路，10个基因富集toll样受体信号通路。上述信号通路均与炎症密切相关。为了阐明杜仲提取物在脑卒中后炎症调节中的作用，作者检测了小鼠皮层中促炎细胞因子的表达水平。实验结果显示，与假手术组相比，模型组IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达明显升高，而杜仲提取物组显示出上述促炎细胞因子的显著下调。上述结果表明，杜仲提取物可抑制脑缺血后促炎因子的产生。
图4 杜仲提取物可减轻缺血性脑卒中小鼠皮质小胶质细胞的极化
为探究杜仲提取物是否抑制脑缺血诱导的梗死周围小胶质细胞活化，作者利用小胶质细胞特异性标志物Iba1的抗体进行免疫荧光组织化学染色，然后激光共聚焦显微镜拍照定量分析，结果显示，与假手术组相比，缺血后Iba1阳性细胞数量明显升高。饲喂杜仲提取物可减弱缺血诱导的小胶质细胞反应。Western blot也观察到类似的结果。小胶质细胞的形态是其较为突出的特征之一，与其功能状态密切相关。为了验证杜仲提取物是否抑制缺血诱导的小胶质细胞形态变化，该研究通过使用 ImageJ 的 Analyze Skeleton 插件测量了几个形态参数。缺血后小胶质细胞分支总长度、平均分支长度及末端分支数显著减少。杜仲提取物有效缓解了这些形态改变。为了全面评估炎症过程中小胶质细胞的形态变化，使用 FracLac for ImageJ测量了小胶质细胞的面积、分形维数、空隙度、圆度、周长和跨度比。分析结果显示，与假手术组相比，模型组的小胶质细胞面积明显减少，饲喂杜仲提取物恢复了这一变化。缺血后小胶质细胞的分形维数、空隙度和圆形度明显增加，杜仲提取物给药后，小胶质细胞的分形维数和空隙性明显低于模型组。然而，各组之间的周长和跨度比等参数没有统计学上的差异。Sholl分析结果显示，与假手术组相比，梗死区域的小胶质细胞分支交叉数量显著减少，特别是在距离为20μm时，而饲喂杜仲提取物交点数量增加。综上所述，结果表明杜仲提取物通过抑制小胶质细胞活化并逆转其缺血性形态改变，发挥神经保护作用。
图5 杜仲提取物抑制缺血诱导的TLR4/ p38 MAPK/NF-κB通路的激活
为了进一步阐明杜仲提取物是否在炎症通路中发挥调节作用，作者采用Western blot检测了缺血性脑卒中小鼠皮质组织中炎症相关蛋白的表达，包括TLR4、NF-κB、p38、p-p38、ERK1/2 和p-ERK1/2。与假手术组相比，模型组TLR4、p-p38 和 NF-κB 表达水平显著升高，而与未给药的缺血性脑卒中小鼠相比，给药7天后杜仲提取物明显降低TLR4、NF-κB和 p-p38的蛋白表达。结果提示，杜仲提取物可抑制TLR4/p38 MAPK和NF-κB信号通路的激活减轻缺血引起的神经炎症。
该研究表明，在缺血性卒中亚急性期给予杜仲提取物可通过减轻皮质炎症促进卒中后功能恢复。杜仲提取物通过抑制小胶质细胞的激活和促炎细胞因子的释放来抑制缺血所致的脑损伤。此外，杜仲提取物的抗炎作用与其调节小胶质细胞形态变化、抑制TLR4/p38 MAPK和NF-κB途径介导的炎症反应密切相关。这些研究结果为开发缺血性脑卒中治疗药物开辟了新的方向，并表明杜仲提取物可能作为开发缺血性脑卒中药物的新候选靶点和思路。
原文链接https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40004043/
